KOD FX, KFX-101

KOD FX是在KOD DNA polymerase基础上开发的高性能PCR试剂。 本酶具有出色的｢扩增成功率｣、「延伸性」和「扩增效率」，可对各种长度的目的片段进行PCR。 KOD FX是PCR成功率非常高，适合于各种实验条件的PCR酶。 实际测序结果表明，KOD FX在PCR过程中，产生碱基错配的频率（错配率）144535个碱基中仅为19个（保真性是Taq DNA polymerase的约11倍）。由此可见，KOD FX的保真性虽比KOD -Plus-、KOD -Plus-Ver.2和KOD -Plus- Neo要差一些，但仍可进行充分的克隆。通过本酶扩增的DNA片段的末端基本上都被平滑化。

特征

●高扩增成功率
对高GC含量的目的片段、细胞悬浊液、小鼠尾巴/植物裂解液、全血、霉菌、酵母等粗样品也可进行高成功率扩增。

●超群的扩增效率
由于得率很高，因此即便模板量很少也可进行扩增。

●出色的延伸性
已确认：以λDNA为模板可以扩增出40kb；以人类基因组DNA为模板可扩增出24kb；以cDNA为模板可扩增出13.5kb。

●通过热启动提高了PCR的反应效率
通过将2种抗KOD单克隆抗体预混合在酶中，抑制了PCR反应前常温状态下的多聚酶活性和3'→5' Exonuclease活性。抗体在PCR最初的变性步骤即发生失活，但对扩增反应没有任何影响。 

注： Buffer A的配置方法请点击下载附件。

实验例

1. 碱裂解法制备的鼠尾裂解液的扩增例

向直接PCR反应液中添加碱裂解法(请参照右边的基本反应条件)制备的鼠尾裂解液0.5μl，以Mouse membrane glycoprotein(Thy-1)gene(M10246)为目的基因，用2步法循环，作30个循环的扩增。

结果显示，只有使用KOD FX时，才可以确认到明确的扩增。碱裂解法，相比使用Proteinase K的方法，操作简单，可以更加简便地分析转基因鼠的基因。

另外，扩增产物无须纯化，以下是用几种限制性内切酶消化处理的结果，可以确认扩增产物可被内切酶完全消化切断。

2. 一步法制备的植物裂解液的扩增例

向直接PCR反应液中添加一步法(请参照右边的基本反应条件)制备的番茄、烟叶、稻叶及精米裂解液1μl，以rbcL为目的基因，用2步法循环，作30个循环的扩增。

结果显示，只有使用KOD FX时，才可以确认到明确的扩增。通过将一步法与KOD FX组合，就可以简便地对植物基因进行分析。

3. 模板DNA量的探讨

使用KOD FX与其他公司的PCR酶，比较了模板DNA的量与扩增效率。

扩增反应中，以0.1ng～100ng的基因组DNA为模板，以human β-globin 2.8kb为目的基因，50μl反应体系，引物15pmoles，KOD FX使用了1U，按2步法，作了30个循环的扩增。

结果显示，相比其他公司的PCR酶，KOD FX可以得到更高的扩增效率。

• 产品内容

• KOD FX(1U/μl)             200μl×1支
  2×PCR Buffer*[KFX-1B]     1.7ml×3支
  2mM dNTP**[NTP-201]        1ml×2支
  
  *含有终浓度2.0mM的Mg ²⁺ 。
  ** 使用本酶进行PCR时，请使用dNTPs[NTP-201]。如果使用其他的dNTPs，有时可能得不到良好的扩增性能。
  ※50μl反应体系的情况下可使用200次。
  
  

  组分:
  50mM Tris-HCl(pH8.0)
  0.1mM EDTA
  1mM DTT
  0.001% Tween ^® 20
  0.001% Nonidet ^® P-40
  50% Glycerol
  
  

  活性的定义:
  在75℃活性测定条件下，在30分钟内摄入10nmoles的全核苷酸使成为酸不溶物时所需酶的活性定义为1U。
  
  

  来源:
  E.coli 重组体

  
  

• 基本反应条件

• 灭菌蒸馏水                   X μl
  2×PCR buffer for KOD FX     25μl
  2mM dNTPs                    10μl（0.4mM）
  各引物                       15pmoles each
  模板                         1～50ng(Plasmid)

•                              10～200ng(Genome DNA) 

•                               ～200ng[RNA相当](cDNA)
                                ～2μl(粗样品)
                               〈一步法植物裂解液1μl〉
  
  KOD FX (1U/μl)              1μl(1U)  

  Total Volume                  50μl
  
  
  〈2步法循环〉*
  94℃ 2min.
  ↓
  98℃ 10sec.
  68℃ 1min./kb 25～40 cycles
  
  〈3步法循环〉*
  94℃ 2min.
  ↓
  98℃ 10sec.
  (Tm-5)℃ 30sec.
  68℃ 1min./kb 25～40 cycles
  
  〈Step down循环〉*
  94℃, 2min.
  ↓
  98℃, 10sec.
  74℃, 1min./kb 5 cycles
  ↓
  98℃, 10sec.
  72℃, 1min./kb 5 cycles
  ↓
  98℃, 10sec.
  70℃, 1min./kb 5 cycles
  ↓
  98℃, 10sec.
  68℃, 1min./kb 15～25 cycles
  ↓
  68℃, 7min.
  *基本上以2步法循环进行。引物的Tm值低于68℃或用2步法循环未见扩增时，请试一下3步法循环。另外，扩增10kb以上的目的片段时，如果出现Long PCR片段或非特异条带及弥散，请试一下Step down循环。

  
  

  ※Tm值采用最邻近法（Nearest Neighbor method）计算得到的值。
  引物的Tm值以及扩增产物的Tm值计算请点击此处进入在线工具

  
  

  
  
  <碱裂解法>
  1) 将鼠尾(约3mm)放入离心管中。
  2) 添加50mM NaOH 180μl。
  3) Vortex充分振荡。
  4) 95℃・10min.
  5) 添加Tris-HC(l pH8.0) 20μl。
  6) Vortex充分振荡。
  7) 离心(12,000rpm, 10min.)
  8) 取0.5～2μl上清进行PCR反应。
  (鼠尾不会也无需完全溶解)
  
  <一步法>
  1) 将叶片(3mm)或精米(1粒) 放入离心管中。
  2) 添加Buffer A* 100μl。
  3) Vortex充分振荡。
  4) 95℃・10min.
  5) Vortex充分振荡。
  6) 离心(12,000rpm, 10min.)
  7) 取1μl上清进行PCR反应。
  (植物组织不会也无需完全溶解)
  *Buffer A:
   100mM Tris-HC(l pH9.5)
   1M KCl
   10mM EDTA
  

  
  

• 几点建议

• 
  

  ●PCR产物的克隆
  由于本酶的PCR产物已被平滑化，可用平滑末端克隆法进行克隆。此时，如已对载体进行了脱磷酸化处理，就需要对PCR产物进行磷酸化，或使用带5'磷酸基的引物。　

  另外，由于本酶的PCR产物已被平滑化，不能直接进行TA克隆。可使用按以下方法开发的TA克隆专用试剂盒「TArget Clone -Plus-」。

  
  

  ●关于引物

  扩增超过10kb的目的片段时，推荐使用OPC以上纯化级度，27mer以上的引物。另外，3'端有错配的引物，可能会受到本酶校正。

  Tm值采用最邻近法(Nearest Neighbor method)计算得到的值。引物的Tm值以及扩增产物的Tm值计算请点击此处进入在线工具。

※其他的实验例

实验例11: 血液(Whole Blood)样品扩增例

实验例12: 培养细胞的扩增例 直接使用细胞悬浊液样品

实验例13: 植物样品(叶・米粒)的PCR扩增例

实验例16: 使用人头发样品进行简便PCR扩增例

实验例21～22

实验例23～24

实验例34: 对福尔马林固定石蜡包埋切片提取的DNA的分析

实验例5: Long Target(〜40Kb)的扩增例

实验例6: 挑战扩增真核细胞最长基因DMD(13.5Kb)的PCR克隆

实验例7: 少量模板(0.1ng～100ng)的扩增例

实验例10: 鼠尾裂解液的扩增例

实验例14: 直接使用鼠尾裂解液：转基因鼠的基因分型

实验例15: 使用转基因鼠鼠尾扩增进行基因分型例

实验例17～20

实验例25: 通过菌落PCR确认酵母重组体

实验例26: 新的水稻OsSRS3基因5′端区域的分离

实验例27: 使用从人粪便提纯的DNA扩增Helicobacter pylori cagA基因

实验例28: 从转基因大鼠血液(滤纸血)检测GFP基因

实验例29: 用DGGE法对沿海生息的植物-浮游生物(隐藻cryptophyta)的多样性分析

实验例30: 使用KOD FX的绿脓菌DNA的基因扩增

实验例31: 小鼠尾巴裂解液的基因组DNA的扩增

实验例32: 对病原酵母Cryptococcus neoformans菌体(菌落)的直接PCR

实验例33: 对米曲菌(Aspergillus oryzae)直接PCR

实验例35: 使用KOD FX对黄色黑腹果蝇羽翼的简便Long PCR法

实验例36: 使用KOD FX对小鼠滤纸血的PCR分析

实验例37: 用KOD FX扩增淡水刚毛藻属藻类（绿藻）DNA片段

实验例38: 用KOD FX对曲霉菌Aspergillus oryzae基因破坏的确认

实验例39: 用KOD FX通过菌落直接PCR检测各种细菌DNA

实验例40: 高成功率PCR酶　用KOD FX对指甲直接进行PCR

实验例41:使用高成功率PCR酶KOD FX

实验例42:用KOD FX对植物叶进行迅速的DNA扩增

实验例43: 通过鳉鱼幼鱼的基因判断其性别的方法

实验例8: 引物设计有限制时的扩增例

实验例9: GC含量高的目的片段的扩增